三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂的制作方法_4

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加 入以下缓冲体系中(1?_前缓冲液40(^1,51恥(:18(^1,10%30320(^1,三蒸水247 4 1, 75 μ I PMSF蛋白酶抑制剂,1 μ I cocktail)用枪头混匀。

[0179] (5)用超声仪器超声,使DNA片段在200_1000bp之间。将超声裂解液以4°C, 13000rpm离心10min取上清,将其转入5ml离心管,加入5倍体积的IP稀释缓冲液稀释。

[0180] (6)DNA超声后片段检测步骤:取适量超声后的裂解液,加入蛋白酶K,65°C孵育4 小时以上解交联,用1%的琼脂糖电泳检测超声后DNA片段的大小。

[0191] 病人样本数据是采用斯隆凯瑟琳癌症纪念医院收集的乳腺癌病人的样本数据,可 以在NCBI GSE2603下载。去除病人中无临床分析的样本,共采用82例病人转移生存年限 的数据。通过matlab的双向聚类分析,将这82例病人分为两组,然后通过病人生存及肿瘤 转移的时间进行两组病人的比较分析。

[0194] 20、细胞生长曲线孔细胞培养板接种密度为4X IO4的细胞悬液1000 μ 1,培养24小时后换液、加 药。在各加药时间点每孔加入100 μ 15mg/ml MTT溶液,培养箱孵育3小时后,吸尽培养液, 加入1000 μ I DMSO充分溶解紫色结晶,酶标仪下以570nm波长测定吸光值(参考波长为 630nm)。以未加药做作为对照,计算细胞的活性。

[0197] 用FITC标记的Annexin V同时结合使用Propidium Iodide (PI)拒染法进行凋亡 细胞检测。具体操作步骤参照BD试剂盒(BD Pharma)说明。在细胞加药一定时间点,胰 酶消化收集细胞,并与消化之前吸出的培液和清洗用的PBS混合,以2 X IO5个细胞/管以 2000rpm速度离心5分钟后弃上清,加入PBS500 μ 1重悬一次,2000rpm离心5分钟后,加入 200 μ 11 X结合缓冲液重悬,2000rpm5分钟离心后,加入200 μ 11 X结合缓冲液,5 μ I PI和 2. 5μ I Annexin V抗体,混匀后室温避光静置15分钟后流式细胞仪测试。

[0199] 按照I :1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,终浓度为10微摩尔/升。细胞收集 后悬浮于稀释好的DCFH-DA中,37°C细胞培养箱内孵育30分钟。用无血清细胞培养液洗涤 细胞三次。流式细胞仪检测DCF-DA的强度。

[0201] 在细胞加药一定时间点,胰酶消化收集细胞,取IXlO6个细胞每管,2000rpm离 心5分钟后弃上清,加入1mlPBS重悬细胞,2000rpm离心5分钟后弃上清,加入4°C预冷 PBS250y 1重悬,然后震荡缓慢加入750μ 1无水乙醇,4°C固定12小时以上后,2000rpm离 心5分钟弃上清,再加入500 μ I PBS重悬,2000rpm离心5分钟弃上清,加入250 μ I PBS重 悬后,加入RNase A至终浓度50 μ g/ml,37°C孵育30min,加入终浓度10 μ g/ml的PI后流 式细胞仪测试。

[0203] 本模型采用6周龄雄性BALB/c裸鼠。HCT116细胞消化后,加入适量PBS洗两遍

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