inductively coupledplasma mass spectrometry响应性释放。细胞摄取和细胞毒性实验表明其具有较强的入胞能力和体外抗肿瘤活性。体内活体成像实验表明其具有较强的跨越
三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）为传统中药砒霜的主要成分，经砒石升华而得，常温下呈白色霜状粉末，无臭无味，微溶于水。自古以来，中医药就应用砷和含砷药物治疗各种难治性疾病[1]，但其毒性限制了其医学应用。20世纪70年代，我国学者首次将ATO用于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的治疗，并且疗效显著[2-4]。随着ATO在APL治疗中的成功，ATO在其他血液肿瘤和实体瘤治疗中的应用得到了积极的研究。最近的研究表明，ATO通过诱导肿瘤细胞自噬、凋亡等发挥抗肿瘤作用，有效抑制肝癌、肺癌和乳腺癌等实体瘤的生长[5-8]。在胶质瘤中，ATO通过靶向胶质瘤相关癌基因（glioma-associated oncogene homolog，GLI）转录效应物对抗刺猬（Hedgehog，Hh）信号通路，抑制肿瘤细胞的生长与发展[9-10]；通过诱导细胞凋亡和自噬、诱导细胞有丝分裂周期阻滞发挥抗肿瘤作用[11-12]；促进细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，导致氧化损伤[13]。ATO可以降低胶质瘤干细胞标志物SOX2、CD133的表达，抑制Hh和Notch通路，抑制其DNA修复能力，降低耐药性[14-15]。此外，ATO还可增强放疗和化疗的效果。然而，由于其较差的生物安全性和狭窄的药物安全窗口，静脉给药到达肿瘤部位并进入肿瘤细胞的量极低。高剂量下的不良反应、高肾清除率和低血脑屏障（blood brain barrier，BBB）通透性阻碍了其在胶质瘤治疗中的应用。
纳米技术的迅速发展为提高化疗疗效和降低化疗毒性提供了可能的途径。纳米粒在肿瘤组织中独特的增强渗透性和保留（enhanced permeability and retention，EPR）效应以及其结构特征（单分散性、均匀性、形态、表面修饰和可调大小）为ATO的肿瘤杀伤作用提供了基础。纳米材料被用作ATO的载体以促进其抗肿瘤作用，克服其肿瘤富集不足的限制，同时减少其不良反应[16]。学者们研究了多种材料作为ATO的纳米载体，包括脂质体[17-18]、蛋白质[19]、聚合物[20-21]、无机纳米粒等[7,22]。其中，基于蛋白质的纳米载体由于其高结构稳定性、优异的生物相容性、极好的生物降解性和易于裁剪性，已迅速成为极具吸引力的药物递送载体[23]。
牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是血浆中含量丰富的内源性蛋白质。BSA不仅对血浆中的内源性溶质（包括金属离子、脂肪酸、氨基酸和代谢物）具有非凡的结合亲和力，而且对许多外源性药物也具有高效的结合亲和力，例如紫杉醇、铂基药物和二氢卟吩e6（chlorin e6，Ce6）[24]。受先前研究的启发，通过砷-硫键将ATO与负载光敏剂Ce6的BSA分子结合，开发了一种具有脑胶质瘤靶向性、促BBB渗透的多功能三元复合物纳米药物递送平台（ATO-BSA@Ce6）。通过联合Ce6的光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）作用，起到协同抗肿瘤的效果，增强ATO靶向性的同时，降低其不良反应。
2.2.1UV-vis光谱测定通过UV-vis分光光度计扫描含相同Ce6质量浓度（2 μg/mL）的Ce6、BSA@Ce6和ATO-BSA@Ce6溶液，测定其在紫外、可见和近红外范围内的吸收光谱，以验证制备成功。结果如图1所示，BSA@Ce6和ATO-BSA@Ce6在404 nm及660 nm处有2个典型的特征峰，这与Ce6的紫外吸收峰保持一致，证明Ce6与BSA的成功结合。
2.2.2荧光光谱通过荧光分光光度计扫描含相同Ce6质量浓度（2 μg/mL）的Ce6、BSA@Ce6和ATO-BSA@Ce6溶液，测定其在500～800 nm的荧光光谱。如图2所示，BSA@Ce6和ATO-BSA@Ce6在665 nm处有明显的发射峰，相较于Ce6在650 nm处的发射峰位置有所偏移，这可能是酰胺键的形成导致发射峰发生偏移。
2.2.3FTIR光谱采用KBr压片法对ATO、BSA、BSA@Ce6、ATO＋BSA＋Ce6的物理混合物、ATO-BSA@Ce6进行红外光谱分析以验证ATO的成功载入。光谱波长记录范围为400～4000 cm−1，分辨率2 cm−1。研究了游离未结合BSA的3种模式，包括由C＝O拉伸（1700～1600 cm−1）产生的酰胺带I、由N-H弯曲和CN伸缩振动（1600～1480 cm−1）产生的酰胺带II和由于C-N拉伸模式与面内N-H弯曲和3300 cm−1处的N-H振动耦合产生的酰胺带III（1400 cm−1）。ATO、BSA、BSA@Ce6、ATO＋BSA＋Ce6的物理混合物、ATO-BSA@Ce6的FTIR光谱如图3所示。在ATO的光谱中，于800 cm−1处检测到特征As-O峰。在ATO＋BSA＋Ce6的物理混合物组中也可以看到相同的峰以及具有BSA特征的其他峰，且基本仅是图谱的叠加，说明ATO与BSA未发生反应，仅是简单的混合物形式存在。在与ATO相互作用后，纯BSA在1395 cm−1处的酰胺III带移至1402 cm−1，且强度增强[25]。物理混合物组显示存在BSA的所有峰，没有峰位移。相对于纯BSA和BSA@Ce6，ATO-BSA@Ce6峰的偏移表明与ATO的成功结合。
2.2.5外观形态分别取少量BSA@Ce6和ATO-BSA@Ce6纳米粒溶液，用蒸馏水稀释至合适的浓度，取10 μL滴于200目碳膜铜网上，室温晾干后，用2%磷钨酸负染，滤纸吸去磷钨酸染液，室温静置，晾干后在透射电镜下观察。结果如图4所示，ATO-BSA@Ce6粒径略大于BSA@Ce6，进一步表明ATO的成功荷载。ATO-BSA@Ce6呈规则球形，形态规整，分散均匀，粒径在60 nm左右，略小于动态光散射激光粒度仪测定结果。
2.2.6包封率和载药量测定ICP-MS测定载ATO的包封率和载药量。取ATO-BSA@Ce6纳米粒溶液0.2 mL，依次加入浓硝酸、30%过氧化氢以及浓盐酸加热消解。用超纯水稀释消解液至5 mL后过0.45μm滤膜，ICP-MS进样测定。设定ICP-MS仪器测试参数：射频功率1150 W，等离子体体积流量13 L/min，辅助气体积流量0.7 L/min，雾化气体积流量0.9 L/min，载气高纯氩气。根据以下公式计算ATO的包封率和载药量分别为（66.72±1.43）%、（10.83±0.21）%。通过测定紫外吸收测定Ce6的包封率和载药量分别为（91.50±0.51）%、（3.45±0.32）%。
2.2.7放置稳定性考察将ATO-BSA@Ce6纳米粒溶液放置在4℃避光保存，在0、2、4、6 d取适量，测定粒径、ζ电位，考察放置稳定性。结果如表2所示，4℃放置6 d ATO-BSA@Ce6粒径和电位无明显变化，表明三元复合物纳米粒在溶液状态下具有良好的放置稳定性。
光敏剂在适当波长的激光照射下可产生ROS，从而诱导细胞损伤和凋亡。利用活性氧荧光探针DCFH-DA检测ATO-BSA@Ce6在激光照射过程中产生的ROS。将DCFH-DA用NaOH（0.01 mol/L）处理30 min，使其水解形成DCFH，随后激光照射（635 nm，120 mW/cm2）含相同Ce6质量浓度（2 μg/mL）的Ce6、BSA@Ce6和ATO-BSA@Ce6溶液5 min，产生的ROS能氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，通过荧光分光光度计测定在激发波长504 nm、发射波长529 nm处的荧光强度。由表3可知，ATO-BSA@Ce6与BSA@Ce6、Ce6产生的ROS荧光强度无显著性差异，表明Ce6经过制剂制备及ATO负载后其性质未发生改变，依然展现良好的ROS生成能力。
三元复合物纳米粒的体外药物释放行为采用透析法进行，使用pH 7.4或pH 6.5的PBS缓冲溶液为释放介质，或加10 mmol/L的GSH。将透析袋（截留相对分子质量8000～14 000）剪成合适长度的小段，置于20 mg/mL的NaHCO3和1 mmol/L EDTA中煮沸10 min进行预处理，并用超纯水洗净。吸取1 mL ATO-BSA@Ce6溶液加入到处理好的透析袋中，两端用透析夹夹紧。置于100 mL PBS溶液（漏槽条件）中，温度为（37.0±0.5）℃，转速100 r/min，分别在0.5、1、2、4、6、8、12、24 h的时间点吸取0.2 mL透析介质中的溶液，并立即补充0.2 mL新鲜的相应透析介质。样品加入2%硝酸溶液稀释至5 mL，放置过夜，经0.45 μm微孔滤膜滤过，通过ICP-MS测定其中As3+的含量，Ce6含量参照上述测定步骤进行UV-vis分析，计算累积释药率，并绘制释药曲线。体外释放结果如图5，游离ATO在不同pH值条件下释放较快，前2 h释放量已经达到90%；相反，纳米粒中ATO在pH 7.4条件下释放较为缓慢，24 h后累积释药率为（57.03±2.61）%。在pH 6.5条件下初始释放速度较快，2 h时即有（43.51±2.29）%的累积释药率，具备明显的pH敏感性，而后逐渐趋于平缓，24 h的累积释放率为（68.37±4.03）%。在含GSH的弱酸性条件下，纳米粒中ATO在24 h时累积释放率为（90.37±3.49）%，接近释放完全。游离Ce6与纳米粒中的Ce6在不同释放介质中均缓慢释放，且ATO-BSA@ Ce6中Ce6释放同样具有pH响应性，在pH 6.5条件下，24 h时累积释放率为（68.72±2.90）%。
为了验证ATO-BSA@Ce6是否能够有效地被肿瘤细胞摄取，比较了Ce6和ATO-BSA@Ce6在GL261细胞中的摄取行为。将GL261细胞以1×106个/孔的密度接种于12孔培养板中，在37℃培养24 h后，吸去培养液，PBS洗涤3次，分别加入含Ce6和ATO-BSA@Ce6（Ce6 2 μg/mL）的无血清培养液孵育4 h，随后用冷的PBS洗涤细胞3次，胰蛋白酶消化，收集细胞，并通过流式细胞术进行分析。结果见图6，GL261细胞对ATO-BSA@Ce6纳米粒的摄取远高于Ce6，表明ATO-BSA@Ce6增强了GL261细胞对Ce6摄取的能力。纳米粒中药物细胞摄取量的增加有望提高抗肿瘤效果。
为了考察ATO-BSA@Ce6增强Ce6摄取的机制，分别在以下条件孵育贴壁细胞：（1）5 mmol/L氯丙嗪以抑制网格蛋白介导的胞吞作用；（2）10 mmol/L甲基-β-环糊精以抑制小窝蛋白介导的胞吞作用；（3）5 mmol/L阿米洛利以抑制巨胞饮作用[24]。将GL261细胞以1×106个/孔的密度接种于12孔培养板中，在37℃培养24 h后，吸去培养液，PBS洗涤3次，用各抑制剂预处理贴壁肿瘤细胞30 min，再加入ATO-BSA@Ce6制剂，孵育2 h。吸弃上层的培养基，随后用冷的PBS洗涤细胞3次，胰蛋白酶消化，收集细胞，并通过流式细胞术进行分析细胞摄取效率。摄取机制实验结果如图7所示，ATO-BSA@Ce6被GL261细胞摄取受到氯丙嗪和甲基-β-环糊精抑制，相对摄取率分别减少至（61.21±4.76）%、（75.52±7.83）%，表明ATO-BSA@Ce6可以通过网格蛋白和小窝蛋白介导的细胞内吞2种途径进入GL261细胞内，从而增强Ce6内化到肿瘤细胞的能力。
取处于对数生长期的GL261细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，37℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。移弃培养液，分别加入含梯度浓度的Ce6、ATO、Ce6＋ATO和ATO-BSA@Ce6。其中含Ce6组给药后4 h用波长为635 nm的激光器照射细胞（120 mW/cm2，1 min）。以未给药的含细胞组为对照组，无细胞孔为空白组，每组设6个复孔。培养至24 h后，吸弃含药培养基，每孔加入100 µL含MTT的无血清培养液，于37℃继续孵育4 h后，吸弃MTT，加入200 µL DMSO，37℃避光摇晃10 min，用酶标仪测定其在490 nm处的吸光度（A）值，根据公式计算细胞存活率。
通过Synergy Finder软件计算药物协同得分，得分＜−10分：表示2种药物之间为相互拮抗的作用；得分−10～10分：表示2种药物之间为加和的相互作用；得分＞10分：表示2种药物之间为相互协同的作用。计算的药物协同得分为10.637，表明ATO＋Ce6对GL261细胞为协同效果。如图8所示，不同质量浓度的ATO＋Ce6＋激光照射和ATO-BSA@Ce6＋激光照射对GL261细胞的增殖均有一定的抑制作用，且随质量浓度的增加，抑制作用明显增加。ATO-BSA@Ce6组对GL261细胞的抑制作用优于ATO＋Ce6组。ATO＋Ce6＋激光照射处理GL261的IC50值为0.54 μg/mL，制备为ATO-BSA@Ce6后，IC50值下降为0.33 μg/mL。说明制备为ATO-BSA@Ce6后，IC50值更低，具有更强的抑制胶质瘤细胞活力的能力。
使用LIVE/DEAD细胞活性检测试剂盒考察细胞毒性。取处于对数生长期的GL261细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板，37℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。吸弃培养液，分别加入含ATO＋Ce6和ATO-BSA@Ce6（Ce6 0.1 μg/mL）的无血清培养基，给药后4 h用波长为635 nm的激光器照射细胞（120 mW/cm2，1 min），以未给药的含细胞组为对照组。再孵育8 h，将细胞用PBS洗涤3次，用Calcein AM和EthD-1共染色30 min，然后使用荧光倒置显微镜观察并拍照。其中活细胞显示绿色荧光（CalceinAM），死细胞显示红色荧光（EthD-1）。
结果如图9所示，对照组、单独激光照射处理的细胞显示绿色荧光，表明单独激光照射处理不会导致细胞死亡。ATO-BSA@Ce6＋激光照射治疗GL261胶质瘤细胞比ATO＋Ce6＋激光照射治疗表现出更强的红色荧光，表明ATO-BSA@Ce6＋激光照射可以更有效地杀伤GL261胶质瘤细胞。
使用DCFH-DA检测经激光照射后GL261细胞中的ROS水平。将处于对数生长期的GL261细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔培养板，37℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。移弃培养液，分别加入含Ce6和ATO-BSA@Ce6的无血清培养基。给药4 h后，加入DCFH-DA（10 μmol/L），并将细胞在37℃下孵育30 min。用PBS洗涤3次后，将细胞用635 nm激光照射1 min。光照结束后，PBS洗涤3次，加入DAPI染色5 min后于荧光倒置显微镜下观察，荧光强度与细胞内ROS产生呈正相关。结果如图10所示，与Ce6相比，经ATO-BSA@Ce6＋激光处理的GL261细胞内Ce6和ROS的荧光强度更强烈，叠加图显示出二者在细胞内的共定位，表明将Ce6制备成三元复合物纳米粒可在GL261细胞内诱导显著的ROS生成。
取处于对数生长期的bEnd.3细胞以1×105个/孔的密度接种于24孔Transwell培养板上室（膜嵌套直径6.5 mm，平均孔径0.4 μm，比表面积0.33 cm2，美国Coring公司）。培养3 d后，用细胞电阻仪监控并测定跨细胞电阻（trans epithelial electric resistanc，TEER），当细胞单层跨细胞电阻大于200 Ω/cm2时方可进行后续实验。对于构建成功的Transwell孔，分别加入含Ce6和ATO-BSA@Ce6（Ce6 2 μg/mL）的无血清培养基，于给药后0.5、1、2、4、6、8、12 h在下室中吸取样品100 μL，并及时补充等量新鲜介质。取样结束后，通过酶标仪测定Ce6的荧光强度。体外BBB透过率通过公式计算。结果如图11所示，随着时间的推移，ATO-BSA@ Ce6通过BBB的量明显多于Ce6组，表明ATO-BSA@Ce6能有效地穿透BBB。
将C56BL/6小鼠随机分为2组：Ce6和ATO- BSA@Ce6（每组n＝3），麻醉，脱毛。尾静脉注射Ce6和ATO-BSA@Ce6（Ce6 2.5 mg/kg），给药后不同时间点（0.5、1、2、4、6、12、24 h）使用小动物活体成像仪观察Ce6荧光强度（Ex＝640 nm，Em＝680 nm）。并在24 h的时间点拍摄后，处死小鼠，解剖，取出脑和主要组织（心、肝、脾、肺、肾），使用小动物活体成像仪拍摄，并用Living Image软件半定量荧光强度，观察ATO-BSA@Ce6在各组织中的分布及跨越BBB进入脑的情况。结果如图12所示，ATO-BSA@Ce6可在较短时间内跨越BBB到达小鼠脑部，并且经过24 h后小鼠脑部仍然存在有明显的荧光信号，而Ce6只在前2 h有少部分可以到达脑部，4 h后几乎没有任何荧光信号。表明ATO-BSA@Ce6能够有效穿透BBB进入脑部，这对于提高ATO的治疗效果同时降低对正常脑组织的毒性有很大帮助。
脑胶质瘤是最常见的恶性原发性脑肿瘤，预后差，复发率高，死亡率高。目前胶质瘤的标准治疗方式是最大限度的手术切除联合放疗和化疗。即使采用了这些积极的治疗方法，总体预后仍然很差，长期生存率很低，只有15～17个月[26]。ATO又称亚砷酸，是中国传统中药砒霜的主要有效成分，常用于治疗溃疡、瘟疫、疟疾等，在现代是治疗APL的有效药物。近年来，大量的研究发现ATO对多种实体瘤具有明显的抑制作用，尤其对于脑胶质瘤具有较好的抗肿瘤活性[16]。然而作为一种水溶性无机盐，ATO靶向性差、生物体内分布不良，被实体肿瘤细胞摄取的情况较差，又因其大剂量使用会导致毒性副作用，这大大增加了运用ATO治疗脑胶质瘤的局限性。
为了改善这些缺点，将这一传统中药与纳米技术相结合，构建了基于ATO的三元复合物纳米粒递送系统，ATO-BSA@Ce6。其中，ATO通过形成砷硫键与BSA结合，该键在GSH和低pH条件下可被破坏，从而将ATO释放。光敏剂Ce6则是通过与BSA形成酰胺键而加载。体外释放研究表明，ATO-BSA@Ce6具有缓释作用，且在弱酸性环境中能实现最大程度的释放。BSA由于其庞大的结构和多个结合位点的存在，是包载或携带药物的理想选择。BSA可以与多种底物结合，包括激素、金属离子、脂肪酸、氨基酸和多种药物。BSA对于血浆内源性物质和外源性药物ATO和Ce6都具有高度亲和力，并且可优先被肿瘤细胞摄取。体外细胞摄取机制研究表明，ATO-BSA@Ce6可以通过网格蛋白和小窝蛋白介导的细胞内吞2种途径进入胶质瘤GL261细胞内，增强药物内化到肿瘤细胞的能力。当ATO-BSA@Ce6处理的细胞暴露于特定波长激光照射时，可观察到协同抗肿瘤作用。体外抗肿瘤活性实验显示，通过载体进行包载及联合治疗后，可以降低ATO的IC50值，在一定程度上提高了ATO的治疗效果。因此将ATO制备成纳米粒，提高ATO的稳定性，促进砷的胞内积累，减少胞外残留，增强对肿瘤细胞的细胞毒性的同时，降低其对正常细胞与组织的毒副作用。将化疗和光动力治疗结合，进一步降低了ATO的给药浓度，也解决了不良反应严重等问题。
BBB的存在是胶质瘤治疗的最大挑战。BBB主要由相邻的脑内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞组成，细胞间紧密连接，仅允许小分子（如离子、溶质、葡萄糖和氨基酸等）通过细胞旁通路、跨细胞通路等保持脑内的健康环境。这种选择性转运方式严重阻碍了治疗药物在胶质瘤部位的积累，导致治疗效果不佳。建立的体外BBB模型表明ATO-BSA@Ce6可有效地跨越BBB。体内活体成像也证明了ATO-BSA@Ce6的脑靶向能力，且在脑部蓄积的时间更长。
综上所述，ATO-BSA@Ce6纳米递送系统能有效改善ATO在治疗脑胶质瘤方面分布缺乏特异性、难以透过BBB等缺点，使ATO具备靶向及缓释特性，显著提高其体外抗肿瘤活性及体内外跨BBB能力，为ATO有效应用于脑胶质瘤的治疗提供了新的研究策略与参考。
来 源：王笑红，张宇婷，吴 婕，李俊松，李 文，王若宁．三氧化二砷三元复合物纳米递送系统的构建及评价 [J]. 中草药, 2022, 53(4): 1382-1391 .返回搜狐，查看更多
